使用熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，通常出現(xiàn)效果不佳的情況，下面小編就帶你了解一些的PCR實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化方法：

一、基本參數(shù)的優(yōu)化

1.1 MgCl2的濃度　在PCR反應(yīng)中，MgCl2的濃度對(duì)影響酶的活性是至關(guān)重要的，不僅如此，合適的MgCl2的濃度還能在反應(yīng)中得到較低的Cp(crossing point)值，較高的熒光信號(hào)強(qiáng)度以及良好的曲線峰值。所以對(duì)其的深度選擇應(yīng)慎重

一般來(lái)說(shuō)，對(duì)以DNA或cDNA為模板的PCR反應(yīng)，應(yīng)選擇2－5 mM濃度的MgCl2，對(duì)以mRNA為模板的RT－PCR而言，則應(yīng)選擇的濃度為4－8 mM。

1.2 模板的濃度：如果研究者是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，那么應(yīng)選擇一系列稀釋濃度的模板來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以選擇出最為合適的模板濃度，如果條件困難，也至少要選擇兩個(gè)稀釋度（高和中、低濃度）來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

一般而言，使Cp位于15－30個(gè)循環(huán)比較合適，若大于30則應(yīng)使用較高的模板濃度，如果Cp小于15則應(yīng)選擇較低的模板深度。對(duì)于Cp值的確定，經(jīng)驗(yàn)上是SYBR Green I探針的熒光信號(hào)比本底高2倍，雜交探針的熒光強(qiáng)度比本底高0.3倍。

二、使用SYBR Green I測(cè)定DNA時(shí)的條件優(yōu)化

2.1 MgCl2的濃度：大多數(shù)引物－模板對(duì)其的要求是2－4 mM。

2.2 模板的濃度：初次實(shí)驗(yàn)要求做一系列的稀釋濃度，如條件限制，至少完成兩個(gè)稀釋的度的測(cè)定。基因組DNA在50 ng-5 pg之間選擇，質(zhì)粒DNA在106拷貝數(shù)左右選擇。

2.3 PCR抑制子：通常用于消除抑制子的辦法是將樣本進(jìn)行稀釋，但是在某些條件下，抑制子的濃度高，而模板量少，稀釋法就不再能達(dá)到好的效果，反會(huì)使反應(yīng)的敏感度降低，所以，研究者若要進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR研究，最好選用純化的模板。

2.4 引物的濃度：引物的濃度是一個(gè)影響PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素，其濃度太低，會(huì)致使反應(yīng)不完，若引物太多，則發(fā)生錯(cuò)配以及產(chǎn)生非特異的產(chǎn)物的可能性會(huì)大大增加。對(duì)于大多數(shù)PCR反應(yīng)，0.5 uM是個(gè)合適的濃度，若初次選用這個(gè)濃度不理想，可在0.3－1.0 uM之間進(jìn)行選擇，直至達(dá)到滿意的結(jié)果。

2.6 退火溫度：實(shí)驗(yàn)設(shè)置的退火溫度應(yīng)比計(jì)算得出的Tm值小5 ℃，然后在1－2 ℃內(nèi)進(jìn)行選擇。一般地，退火溫度要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定，這個(gè)經(jīng)驗(yàn)值往往會(huì)同計(jì)算得到的Tm值有較大的差距。

三、用SYBR Green I進(jìn)行一步法RT－PCR的條件優(yōu)化

3.1 MgCl2的濃度：不同的靶分子選用不同的濃度，通常是在4－8 mM之間選擇。

3.2 模板的濃度：RT－PCR實(shí)驗(yàn)既可以選用總RNA，又可以選用mRNA，其濃度應(yīng)在1 pg-1 ug之間選擇。對(duì)于低模板濃度，可以增加適量的MS2或用alternative RNA 作為載體進(jìn)行測(cè)定。

3.3 對(duì)照設(shè)置：每一引物都應(yīng)設(shè)有陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照和污染對(duì)照。

四、雜交探針測(cè)定DNA

4.1 MgCl2的濃度：在2－4 mM的基礎(chǔ)上加0.5－1.0 mM，但是不要超過(guò)2.0 mM。

4.2 雜交探針的濃度：初次實(shí)驗(yàn)每個(gè)探針用0.2 uM，如果信號(hào)強(qiáng)度達(dá)不到要求，可以增加至0.4 uM。

4.3 對(duì)照設(shè)置：每一引物都要設(shè)陰性對(duì)照，每一探針都要設(shè)陰性對(duì)照。每次實(shí)驗(yàn)都要設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。

4.4 其它的條件同SYBR Green I。

五、用雜交探針實(shí)時(shí)定量RT－PCR

5.1 MgCl2的濃度：在4－8 mM之間進(jìn)行選擇。

5.2 雜交探針的濃度：初實(shí)驗(yàn)用0.2 uM，如果熒光信號(hào)強(qiáng)度不足，可以增加至0.4 uM。

5.3 模板濃度設(shè)置：優(yōu)化的擴(kuò)增須進(jìn)行一系列知釋度的實(shí)驗(yàn)，在條件有困難的條件下，至少要進(jìn)行兩個(gè)稀釋度的測(cè)定。選用1 pg-1 ug的總RNA或是mRNA，若是模板的濃度過(guò)小（小于10 ng/ul）,則可加入MS2或alternative RNA作為載體。

5.4 對(duì)照設(shè)置：每個(gè)引物都要設(shè)無(wú)模板對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照以及污染對(duì)照。

六、關(guān)于雜交探針的評(píng)價(jià)

在使用雜交探針進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須注意防止探針－引物二聚體的形成和其本身在反應(yīng)過(guò)程中的延伸。引物－探針二聚體的形成，主要是因?yàn)樘结樋膳c引物的3’末端雜交，其形成以后，會(huì)致使此二聚體擴(kuò)增，從而同目的基因競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的原料，致反應(yīng)的效率下降。

探針其本身能同目的基因相結(jié)合，且其解鏈溫度高于引物，所以它可能作為引物而引發(fā)延伸反應(yīng)，為了防止發(fā)生這種現(xiàn)象，通常是將其3’末端全磷酸化，使之不能延伸，若此磷酸化不全或是沒(méi)有磷酸化，就會(huì)產(chǎn)生目的基因的副產(chǎn)品，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。鑒于以上這兩點(diǎn)，所以應(yīng)對(duì)探針精心設(shè)計(jì)，并將其末端全磷酸化。